　　針對(duì)禽支氣管炎病毒基因組高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含禽支氣管炎基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

檢驗(yàn)方法
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)	RT-PCR反應(yīng)液	15.0 μL
	逆轉(zhuǎn)錄酶	2.0 μL
	Taq酶	3.0 μL

(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集禽白血病病毒熒光信號(hào)
PCR 反應(yīng) 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉(zhuǎn)錄	42℃：10分鐘（min）	1
	預(yù)變性	95℃：3分鐘（min）	1
	預(yù)擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	5
	預(yù)擴(kuò)增	55℃：40秒（s）	5
	PCR擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	40
	PCR擴(kuò)增	55℃：40秒（s）（此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)）	40

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇 None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果	標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋
FAM	標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋
+	標(biāo)本中檢出禽白血病病毒RNA
-	標(biāo)本中未檢出禽白血病病毒 RNA

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出限shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
產(chǎn)品的檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

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